摘要： 为研究门冬胰岛素制备工艺，参照毕赤酵母偏好密码子，设计合成Ｎ－端连接引导肽ＥＥＡＥＡＥＡＥＰＫ，以ＫＥＷＫ作为短Ｃ肽，Ａ、Ｂ链结构完整的门冬胰岛素ｃＤＮＡ序列。利用ＸｈｏＩ－ＮｏｔＩ酶切位点将其插入表达质粒ｐＰＩＣＺαＡ，采用电转移方法将重组质粒转入毕赤酵母ｘ－３３，筛选高拷贝重组子作为工程菌株进行高密度发酵，表达量可达到０．５７ｇ／Ｌ。发酵液经金属螯合层析和ＳＰ阳离子层析纯化后鉴定正确。建立ＣＰＢ／Ｔｒｙｐｓｉｎ双酶切工艺，对不同温度及ｐＨ条件下产生的酶切产物进行分析，初步建立了酶切最佳ｐＨ值和温度条件。酶切产物经纯化后制得纯度为９１．７％的门冬胰岛素，副产物为Ｂ链３０位缺失的门冬胰岛素。该设计方法为含短Ｃ肽ＥＷＫ门冬胰岛素制备中选用Ｌｙｓ－ｃ酶切成本过高的问题提供了备选解决方案。